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岛津液相色谱仪教材

文章出处:电竞app 人气:发表时间:2020-03-10 17:19

  岛津液相色谱仪教材_化学_自然科学_专业资料。岛津液相色谱仪基础知识 岛津企业管理(中国)有限公司 分析仪器事业部 分析中心 岛津HPLC的历史 Started in 1969 1969 1972 1978 1981 GPC系统开发 LC-

  岛津液相色谱仪基础知识 岛津企业管理(中国)有限公司 分析仪器事业部 分析中心 岛津HPLC的历史 Started in 1969 1969 1972 1978 1981 GPC系统开发 LC-1(LC-830)销售 LC-3A系列销售 LC-4A系列销售 <与DuPont签订许可合同后制造销售> <CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征> <内置微型计算机的全自动HPLC> <世界上首创的微量型LC对应HPLC> <世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身> <世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器> <采用有效性支持功能的积木型HPLC> <追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC> 1982 1984 1991 1997 2000 2004 LC-5A系列销售 LC-6A系列销售 LC-10A系列销售 LC-VP系列销售 LC-2010销售 LC-20A Prominence销售 <为分析实验室带来革新的HPLC > <为了让LC分析更为便捷 <130MPa耐压系统,低系统容量,高温分析和样品自动前处理> 2010 2010 LC-15C销售 LC-30A Nexera销售 在售产品 岛津HPLC的历史 2000 1997 THECNLOGY BREAKTHROUGH Flexible HPLC System with Micro-stroke Volume Solvent Delivery Unit THECNLOGY BREAKTHROUGH LC-2010 LC-VP 2008 2004 THECNLOGY BREAKTHROUGH 2010 THECNLOGY BREAKTHROUGH THECNLOGY BREAKTHROUGH 2010 THECNLOGY BREAKTHROUGH LC-20A Prominence UFLC Prominence LC-15C Essentia UHPLC LC-30A Nexera LC-20A Prominence 基础知识讲解内容 1、色谱基础知识 2、硬件基础知识 3、定量基础知识 4、维护基础知识 第一部分 色谱基础知识 色谱起源 石油醚 色谱 色素混合物 碳酸钙颗粒 分离组分 色谱发展史 20世纪初,俄国植物学家M.S. Tswett提出经典液相色谱法; 20-30年代,柱分配色谱和纸色谱; 50年代,气相色谱,薄层色谱; 60年代,凝胶渗透色谱及高效液相色谱; 70年代,高效毛细管气相色谱法; 80年代,电色谱; 90年代,光色谱。 色谱定义 色谱法:利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相:携带样品流过整个系统的流体 固定相:静止不动的一相,色谱柱 mV 500 色谱是一种分离技术 色谱的主要目的是对混合物中的目标物 分离和定量 Propyl Parab en Methyl Parab en Ethyl Parab en Butyl Parab en 400 300 200 100 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 min 色谱分类 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 气相色谱 Gas Chromatography (GC) 薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC) 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis (CE) HPLC vs GC 液相色谱: 以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点、大分子、强极性 和热稳定性差的化合物的分析 流动相具有运载样品分子和选择 性分离的双重作用 气相色谱: 以气体作为流动相的色谱分离方法 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子 化合物的分析 流动相只起运载样品分子的能力 HPLC简易流程图 输液泵 进样器 柱温箱 检测器 色谱柱 数据处理系统 储液瓶 HPLC特点 分离性能好 -9~10-12 g)灵敏度高 (10 选择性高(同分异构,旋光异构) 分析速度快 进样量小(1-100 μL) HPLC分类 反相色谱(reversed phase chromatography) 离子对色谱(ion-pair chromatography) 正相色谱(normal phase chromatography) 离子交换色谱(ion exchange chromatography) 尺寸排阻色谱(GPC / GFC) 反相色谱 ——流动相的极性大于固定相的极性 C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) 苯基 TMS 氰基 非极性 -O-Si(CH3)2-C18H37 SiO2 相互作用力是什么 疏水性 OH C18 (ODS) 弱 SiO2 强 OH 疏水性 如果样品有 – CH3CH2CH2 – 碳链 芳香基 作用力强 如果样品有 – COOH 羧基 – NH2 氨基 – OH 羟基 作用力弱 反相色谱流动相的选择 优化水相(缓冲液)和有机相的比例非常重要 甲醇、乙腈和THF是常用的有机溶剂。 在有缓冲液的情况下,缓冲液的浓度和pH值 非常重要。 流动相极性变化对分离的影响 20 % 水 30 % 水 40% 水 1: 2: 3: 4: 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸乙酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯 有机相: 甲醇 固定相极性变化对分离的影响 C8 SiO2 C18 (ODS) 一般 样品 SiO2 强 样品 C4 SiO2 弱 样品 固定相极性变化对分离的影响 ODS C8 TMS 分析条件 柱: Shim-pack CLC-ODS 流动相: MeOH : H2O = 7:3 流速: 1.0 mL/min 温度: 40℃ 进样体积: 10 μL 检测器: UV-254 nm 色谱峰 1. 苯甲酸甲酯 2. 苯甲酸乙酯 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯 反相离子对色谱 原理 固定相 流动相 样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水 性离子对,而为反相色谱固定相保留。 疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂或键合的硅胶 水(缓冲液)+ 离子对试剂 + 有机溶剂 离子对试剂 所带电荷与待测离子相反 常用离子对试剂 阴离子化合物 – 氢氧化四丁基铵 – 溴化四丁基铵 阳离子化合物 – 丁烷基磺酸钠 – 戊烷基磺酸钠 – 己烷基磺酸钠 – 庚烷基磺酸钠 – 辛烷基磺酸钠 – 癸烷基磺酸钠 – 十二烷基磺酸钠 (C4) (C5) (C6) (C7) (C8) (C10) (SDS) 反相离子对色谱流动相的选择 离子对试剂的类型 所带电荷与待测物质相反 离子对试剂的浓度 10-4~10-2 mol/L 在一定范围内,浓度越大,被分离物的保留值越大。 流动相的 pH 反相离子对色谱应用 有机酸、碱、盐的分离 包括 — — — — — — — 阴阳离子表面活性剂 大分子脂肪酸 烷基磺酸盐和芳香硫酸盐 含氮化合物 生物碱 水溶性维生素 酚类 正相色谱 ——流动相的极性小于固定相的极性 硅 胶 柱: 氰 基 柱: 氨 基 柱: 二醇基柱: 常用 常用 分析糖 分析蛋白质 -Si-CH2CH2CH2CN SiO2 SiO2 -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) 硅胶 化学键合相 相互作用力是什么 强 SiOH SiOH HO 氢键力 弱 非常弱 OH 氢键力 如果样品有 – COOH 羧基 – NH2 氨基 – OH 羟基 氢键力强 如果样品没有任何官能团,如碳水化合物 如果样品有大的基团, 由于空间位阻 氢键力弱 正相模式下流动相的选择 主要试剂 烷烃 (戊烷、己烷、庚烷、辛烷) 芳香烃 (苯、甲苯、二甲苯) 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳 辅助试剂 甲基-t-丁基醚(MTBE),,四氢呋喃(THF),二氧杂 环乙烷, 嘧啶,乙酸乙酯,乙腈,丙酮,异丙醇,乙醇, 甲醇 为了调整保留时间,可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。 流动相极性变化对分离的影响 0 % 甲醇 2 % 甲醇 5% 甲醇 1: 2: 3: 4: 邻苯二甲酸二辛酯 邻苯二甲酸二丁酯 邻苯二甲酸二乙酯 邻苯二甲酸二甲酯 主要试剂 : 己烷 反相色谱与正相色谱的对比 反相色谱 流动相极性大于固定相极性 适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物分离 正相色谱 流动相极性小于固定相极性 适用于不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混 合物的分离和制备HPLC 反相色谱与正相色谱的对比 反相 – 保留时间重现性好 – 固定相耐用 正相 – 对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等) – 保留时间重现性稍差 离子交换色谱 原理:利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差 异来实现分离 固定相:离子交换树脂 流动相:水缓冲溶液(常用)或有机溶剂与水缓冲溶液的混 合液 离子交换色谱所用的缓冲液: 阴离子分离:氢氧化物、硼酸盐、碳酸盐、酚盐和两性离子等 阳离子分离:矿物酸,如硝酸、盐酸、硫酸和甲基磺酸等 离子交换色谱作用力 离子吸引力 样品 +++++ + +样品 + ++ ++ + R +RN R SO 3 离子交换色谱应用 生物领域(蛋白质、农药、氨基酸分析) 离子分 阳离子交换剂 -) 强阳离子交换剂( SCX)(R-SO3 WCX) -)弱阳离子交换剂( (R-COO 阴离子交换剂 +) 强阴离子交换剂 (SAX) (R4N 弱阴离子交换剂 (WAX)(DEAE) 尺寸排阻色谱法(SEC) 原理:利用多孔凝胶固定相的独特特性,而产生的 一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色 谱方法。 固定相:一种表面惰性、具有一定孔径的多孔凝胶 应用: 聚合物及生命科学领域 SEC分类 凝胶渗透色谱 (GPC) 主要用于聚合物领域 以有机溶剂为流动相(氯仿,THF,DMF) 常用固定相填料:苯乙烯-二乙烯基苯共聚物 凝胶过滤色谱 (GFC) 主要用于生命科学领域 以水溶液为流动相 常用固定相填料:亲水性有机凝胶(葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰 胺等) GPC分离原理 固定相是多孔填料,小分子样品可以进入孔径内部 样品与固定相之间无作用力 保留时间不同 样品 填充物颗粒 大 中 小 孔穴 GPC分离原理 排阻极限 Log (M W) 渗透极限 V 第二部分 硬件基础知识 HPLC简易流程图 脱气机 色谱柱 进样器 输液泵 储液瓶 柱温箱 数据处理系统 检测器 储液瓶 由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚 四氟乙烯材料制成 使用过程中储液瓶应适当密闭 所有溶剂应先过滤,再装入储液瓶 溶剂前处理-过滤 过滤:0.45 μm或更小孔径滤膜 目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞 色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液 滤膜类型: 聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐。 醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水 基溶剂。 尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶 液,可以用于强酸,不适用于 DMF,THF, CHCl3 等溶剂。 再生纤维素滤膜:蛋白吸收低,同样适用于水溶性样 品和有机溶剂。 溶剂前处理-脱气 脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响: 1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积 2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形 3)检测器中的气泡产生基线波动 常用脱气方法 超声脱气 减压脱气 在线脱气 脱气机-在线真空脱气 组成: 脱气机主要由脱气管、真空室和 真空泵组成。 脱气管 真空室 到泵 真空室内的脱气管由特殊的 透析材料制成,当溶剂流经脱气 管时,溶解在溶剂中的气体穿过 管壁被脱出。 储液瓶 输液泵 性能要求 – 能在高压下连续工作 – 输出流量范围宽 – 输出流量稳定、精确度、重复性高 47 岛津输液泵系列 目的 单元 LC-20AT LC-15C 流速范围 0.001-10ml/min 0.0001-10ml/min 0.0001-5ml/min 0.0001-10ml/min 特性和应用 非凡的耐用性,适于常量 分析 分析 LC-20AD LC-30A LC-20AB 极低脉动,适于半微量LC 和LC-MS分析 极低脉动,适于半微量LC 和 LC-MS分析 LC-20AT 选配件 支架 压力传感器 泵头固定座 泵头 辅助进口单向阀 主进口单向阀 LC-20AT 主泵头 副泵头 串联式柱塞往复泵 单向阀 LC-20AD 选配件支架 出口单向阀 压力传感器 泵头 进口单向阀 LC-20AD 泵头固 定座 进液口 泵头 泵头 单向阀 并联式微体积柱塞往复泵 LC-20AB 压力传感器 连接块 出口单向阀 泵头 泵头固定座 进口单向阀 泵B LC-20AB 进液口 泵A 柱塞往复泵结构示意图 单向阀工作原理 单向阀结构 单向阀工作原理 吸液冲程 宝石球 抛光面 泵头 球座 进口单向阀 出口单向阀 排液冲程 洗脱系统组成 等度洗脱系统 高压梯度洗脱系统 低压梯度洗脱系统 梯度洗脱系统{ 等度 B% B% 梯度 时间 时间 使用梯度洗脱的原因 当采用等度洗脱时: MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长 分离度差 MeOH / H2O = 8 / 2 ( column : ODS ) 使用梯度洗脱的原因 当采用梯度洗脱时: 95% 甲 醇 浓 度 30% 在最短时间内获得最佳的分离 梯度洗脱要点 梯度洗脱: 优点:可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度 注意事项: 溶剂的纯度要高,否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如紫 外吸收检测器或荧光检测器),而不能使用对流动相组成变化敏 感的通用型检测器(如示差折光检测器) 查看空白实验的数据 遵守分析周期(最初的分析数据不采用) 等度洗脱 输液泵 进样器 柱温箱 检测器 色谱柱 单一或混合溶剂 高压梯度系统 A 泵 B 混合器 泵 进样器 分析柱 柱温箱 检测器 数据处理系统 C 泵 梯度准确率高 需要2-3个泵 可以不配在线脱气机 低压梯度系统 混合器 分析柱 进样器 输液泵 低压梯度比例阀 检测器 柱温箱 数据处理系统 脱气机 一台泵最多可使用4种流动相 泵前预混合 需带在线脱气机 A B C D 流动相的选择 采用“HPLC”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 水的等级 水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水 吸 光 率 去离子水 纯化水 波长 (nm) 因为不纯物的存在,去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物 水的等级 HPLC用水可以通过以下几个方法得到: 专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2 M? 的超纯水, 并通过0.22 μm的滤膜,除去热源、有机物、 无机离子及空气等 去离子水重蒸 二次或三次重蒸水 不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水 水的等级 未注入样品时空白梯度的色谱图 水中不纯物的出峰 水中的不纯物保留在柱中,随之被乙腈洗脱 有机溶剂的等级 有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯 微量分析、梯度洗脱 都经过蒸馏和0.45 μm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒) 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2 μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质 有机溶剂的等级 分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图 甲醇 乙腈 正己烷 选择缓冲液的步骤 1. 确定最佳分离状态时的流动相pH 2. 选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液 (即使浓度稀也具有较强的缓冲能力) 3. 确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 (在波长210nm附近进行检测时,不能用醋 酸和柠檬酸的缓冲液) 常用代表性的弱酸的pKa值 pK1 pK2 pK3 醋酸 柠檬酸 4.87 3.13 2.16 4.76 7.21 6.40 12.32 磷酸 缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ,以免造成腐蚀、磨损、 阻塞: 用纯水冲洗30-60 min(1 ml/min),再用甲 醇冲洗30 min。 易受到细菌和霉菌的影响 不能直接用有机溶剂 冲洗缓冲盐溶液 进样器 手动进样器 自动进样器 要求: 无残留 扩散小 进样体积可变 可承受高压 手动进样器的原理图 装填状态 泵 进样状态 泵 6 1 2 6 1 2 5 3 5 柱子 3 4 4 柱子 1 6 1 6 4 5 4 5 进样量和检测器响应的关系示意图 检 测 器 响 应 值 全量注入 部分注入 定量环体积的一半 3倍定量环体积 进样体积 部分注入和全量注入 部分注入:一般要求进样量最多为定量环体积的一半,如 20μL的定量环最多进样10μL的样品,并且要求每次进样体积 准确、相同。 全量注入:进样量最少为定量环体积的3至5倍,即20μL的定 量环最少进样60至100μL的样品,这样才能完全置换样品定量 环内残留的溶液,达到所要求的精密度及重现性。 交叉污染产生的原因 红色表示残留样品 手动进样方法 一般的方法 1.在进样状态下清洗针口 2.在装填状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到进样状态 手动进样方法 便捷的方法(不需清洗) 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态 自动进样器 由计算机自动控 制定量阀,按预先编 制注射样品的操作程 序工作。 自动进样器 清洗(Rinse):进样针移动到清洗口,针的外壁被清洗 液清洗的过程。 排气(Purge):排除管路中的气泡和更换旧流动相的 过 程。 色谱柱 常用色谱柱 反相 C18 (ODS) 、C8 、C4 、苯基、TMS、 氰基 正相 硅胶、氰基 、氨基、二醇基 离子交换色谱 阳离子交换剂 ? 强阳离子交换剂(SCX) ? 弱阳离子交换剂(WCX) 阴离子交换剂 ? 强阴离子交换剂(SAX) ? 弱阴离子交换剂(WAX) R-SO3R-COONR4+ DEAE 体积排阻色谱 苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺 分离模式的选择 反相色谱:第一选择 反相离子对色谱/正相色谱:第二选择 特殊: 高分子量化合物:聚合物、 蛋白或糖类 无机离子 光学异构体 色谱柱的选择 105 分 子 量 104 非水相 体积排阻 离子交换 离子对反相 反相 103 水相正相 非极性 中等极性 高极性 色谱柱的连接 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题 色谱柱 公螺母 死体积 管线 好的连接 差的连接 色谱柱的使用 新色谱柱使用前: 最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 min,长时间未用的分析柱也要同样处理 新色谱柱先测柱效,并保留色谱图和实验条件 定期检测柱效 色谱柱的使用 1. 流动相:高纯度,过滤 pH范围 有机溶剂与色谱柱匹配互溶、并能溶解 样品 2. 净化样品 3.使用保护柱:与色谱柱填料、内径一致 避免色谱柱污染 色谱柱的使用 4. 分离条件—流速、柱温、梯度的变化幅度 5. 定期使用强溶剂冲洗柱子 6. 使用缓冲盐后,要先用含10%甲醇的水溶液冲洗, 再用有机溶剂冲洗 7. 流动相正相反相转换时用异丙醇过渡 色谱柱的存放 存放前充分冲洗 合适的存放溶剂 接好堵头,避免固定相干涸 存放环境 柱温箱 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 柱温箱 CTO-20A/AC 空气强制循环式 CTO-15C 模块加热式 CTO-30A CT O10A S 液相色谱检测器的选择 样品的性质 分离目的不同,对检测的要求不同 定量:高选择性、高灵敏度 定性或制备:通用性 常用检测器 紫外可见光检测器 (UV) 二极管阵列检测器 (PDA) 荧光检测器 (RF) 示差折光检测器 (RID) 电导检测器 (CDD) 蒸发光散射检测器 (ELSD) 质谱检测器 (LCMS) 紫外可见光检测器 样品池 C : 浓度 Ein l Eout 朗伯-比耳定律 A= εCl = - log (Eout / Ein) (A : 吸光度) 紫外可见光检测器 样品池 光栅 λ Ein Eout 光电二极管 Ein Ein 参比池 光电二极管 D2 / W 光源 紫外可见光检测器 紫外检测器 原理:基于被分析组分对特定波长紫外光的选择 性吸收。 定量基础:朗伯-比耳定律,A=εCL 优点: 1)灵敏度高 2)对温度和流速不敏感 3)可用于梯度洗脱 缺点:仅适用于测定有紫外吸收的物质 双波长检测 日本饮用水标准(2004年4月起实施 ) 1.磺草灵(asulam) 2.甲基硫菌灵(thiophanate-methyl) 3.环草隆1(siduron) 4.环草隆2(siduron) 5.依普同(iprodione) 分析条件: 色谱柱:Shim-pack VP-ODS (150 mmL. × 4.6 mmI.D.) 流动相:Acetonitrile/ 50 mM KH2PO4(pH3.0) =55/45(v/v%) 流速:1.0 mL/min 柱温 : 40?C 检测 : 230 nm, 270 nm 进样 : 10 ? L 饮用水中4种农药残留双波长分析 波长切换 波长扫描 紫外检测器 启动仪器或开灯后,需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时,请关闭前面板 清洗流通池,防止堵塞 标准流通池:12 ?L,耐压12 MPa (半微量流通池:2.5 ? L) 氘灯:2000小时,不要频繁的开关(3小时) 二极管阵列检测器 二极管阵列检测器 样品池 光栅 D2 / W 灯 每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值 二极管阵列 二极管阵列检测器 光谱 色谱 吸 光 度 波 长 时间 二极管阵列检测器 二极管阵列检测器 采集三维谱图,可以发现单波长检测时未 检测到的峰 光谱定性,谱库搜索 峰纯度检验 二极管阵列检测器 启动仪器或开灯后,需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时,请关闭前面板 清洗流通池,防止堵塞 标准流通池:10 ? L,耐压12 MPa (半微量流通池:2.5 ? L) 氘灯:2000小时,不要频繁的开关(3小时) 荧光检测器 激发波长 + hν1 * * A* hν1 A hν2 hν2+ 发射波长 荧光 荧光检测器 氙灯 光电倍增管 光栅 样品池 荧光检测器 荧光检测器 原理:基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点: 1)灵敏度高,是最灵敏的检测器之一 2)选择性好 3)对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱 缺点:仅适用于测定可产生荧光的物质或能经过衍生化 反应产生荧光的物质 可检测物质:多环芳烃、霉菌毒素、卟啉、儿茶酚氨等(具 有对称共轭体系)或氨基酸、脂肪酸等需衍生后检测样品 荧光检测器 启动仪器或开灯后,需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时,请关闭前面板 清洗流通池,防止堵塞 oC时, 温度上升,荧光强度下降(常温附近温度变化超过 1 有些化合物强度变化达到5%) 标准流通池:12 ? L,耐压2 MPa 氙灯:2000小时(RF-20AxL),不要频繁的开关 荧光检测器应用 氨基酸检测-OPA衍生 CHO CHO o-phthalaldhyde (OPA) A A N-R + R-NH2 脂肪酸检测-ADAM衍生 + R-COOH CHN2 9-anthryldiazomethane (ADAM) CH2OCOR 氨基酸检测-OPA柱后衍生 mV Tauri 700 检测器 A:Ex:350nm,Em:450nm ne 600 500 400 300 Thr AspSer Glu Pro Gly Met isoLeu Leu Val Tyr Phe His 200 100 0 0.0 5.0 Ala Cys Lys Ammoni Arg a 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0min 各组分浓度:0.02 ? mol/mL,进样10 ? L 示差折光检测器 光学系统 钨灯 准直镜 狭缝 物镜 狭缝 反射镜 调零透镜 样品池 硅光电池 示差折光检测器 示差折光检测器 示差折光检测器 原理:连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中 各组分浓度。 优点:通用型检测器 缺点: 1)对温度变化敏感 2)对溶剂组成变化敏感,不能用于梯度检测 3)属于中等灵敏度的检测器 示差折光检测器 检测时,请关闭前面板 清洗流通池,防止堵塞 流通池:9 ? L,耐压2 MPa 进口:63.5 ? L 出口:280.2 ? L 钨灯:20000小时 糖分析例 分析条件 色谱柱 : Shim-pack CLC-NH2 流动相 : 乙腈 / 水= 7 / 3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 室温 峰 1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6.甘露糖 7. 乳糖 电导检测器 V I K (电导) = I [A] / E [V] 2] / L [cm] x k=A [cm (k : 电导率) k= (I/E)x(L/A) A L A 电极 电极 电导检测器 原理:根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来 测定电离物质含量,广泛应用于离子色谱法。 优点:对流动相流速和压力的改变不敏感 缺点:对温度变化敏感 (温度每升高1℃,电导率增加2 %-2.5 %) 用途:主要用于离子色谱,检测无机和有机离子 电导检测器 清洗流通池,防止堵塞 流通池:0.25 ? L,耐压2.9 MPa 海水中阴离子分析例 分析条件 色谱柱 : Shim-pack IC-A3 流动相 : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris 流速: 1.5 mL/min 温度: 40℃ 进样体积 : 100 ? L 色谱峰 1. F2. Cl 3. NO24. Br 5. NO36. SO4 2- (1.4 ppm) (10200 ppm) (10 ppm) (43 ppm) (44 ppm) (431 ppm) 阳离子分析例 + + + + 2+ 2+ 分析条件 色谱柱 : Shim-pack IC-C1 流动相 : 5 nM 硝酸溶液 流速 : 1.5 mL/min 温度 : 40oC 进样:50 ? L 蒸发光散射检测器 流动相 雾化 载气 雾化器 蒸发 光电倍增管 检测池 检测 光源 光电倍增管 漂移管 LED 蒸发光散射检测器 原理: 流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴,溶剂挥发 后,溶质形成微小颗粒,被载气带到检测系统,进入散射室 中,检验散射光的强度。 优点: 消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移,可梯度 洗脱,灵敏度高,是HPLC的通用型检测器。 缺点: 不能使用非挥发性缓冲盐做流动相,如磷酸盐。 蒸发光散射检测器 废气不能直接排放在室内 如果流动相中含有机溶剂,使用惰性气体做雾化气 避免使用在工作温度下能引起爆炸的溶剂和雾化气 流动相中不使用非挥发性盐 雾化气压力不要超过450 kPa 先开气,后开泵 保证雾化器虹吸出口充满液体 不要打开前门 LED灯:5000小时 PEG-1000分析例 质谱检测器 强大的定性和选择性能力 多组份样品的准确定性 未充分分离组份峰的鉴别 消除杂质干扰 可作为便捷的定性分析 用于合成和衍生反应的研究 作NMR预分析的质谱鉴定 人造色素质谱图 (x1,000,000) 8.0 7.0 1 23 4 5 6 8 9 7 10 11 12 6.0 5.0 TIC 4.0 3.0 2.0 1.0 m/z 467 m/z 537 m/z 421 m/z 407 m/z 451 m/z 763 m/z 747 m/z 557 m/z 784.5 m/z 834.5 m/z 972.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min 0.0 0.0 色谱柱: 流动相: 时间程序: 流速: 进样体积: 柱温: Shim-pack XR-ODS (50 mmL x 2.0 mmI.D. Particle size: 2.2 ? m) A; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) B; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) /A CN=1/1 10%B (0 min) - 100%B (5.0 min) 0.5 mL/min 5? L 40 ? C 扫描范围 m/z 200-1200 1: tartrazine 2: amaranth 3: indigo carmine, 4: new coccine 5: sunset yellow FCF 6: allura red AC 7: fast green FCF 8: brilliant blue FCF 9: acid red 10: phloxine B 11: erythrosine 12: rose bengal 第三部分 定量基础知识 定性方法 色谱峰的定性鉴别 通过保留值(通常是保留时间)进行定性 需要指定保留时间误差范围(时间窗、时间带) 在相同的分析条件下 保留时间相同并不肯定是同样的组份 保留时间不同肯定不是同样的组份 定性确证 仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质 通过加入标准物确认 通过改变色谱条件确认 光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段 其他仪器方法确证 定量分析的基本要求 需要有纯物质作标准 被定量组分峰要与其它峰达到基线分离 符合定性参数要求 选择合适的定量方法 定量分析基本公式 在某些条件限定下,被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。 (蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性,分别取对数后成线性 ) Ci= fi Ai Ci= fi Hi Ci: fi: Ai: Hi: 组分浓度 响应因子,与组分的物理化学性质和检测器的性质有关 组分响应面积 组分响应高度 实际修饰公式: Y=aX+b 常用定量方法 面积归一化 外标法 内标法 标准加入法 面积归一化法 不能作为准确定量的方法,仅在特定情况下使用 公式 特点: Ai Ci % =× 100 % Ai ∑ 1、无需做校正,简便,快速 2、进样量不严格要求 3、要求所有组分都流出并且被检测到 4、要求所有组分的响应因子相当 外标法 浓度 面积 峰面积 A1 C1 A4 A2 C2 A3 标准曲线 外标法 C i = f i Ai fi——i 组分工作曲线的斜率 实验室最常用的定量方法,定量结果准确 特点: 1、不需所有峰都流出或被检测到,只对目标组分作校正 2、需要标准样品 3、进样量必须准确 4、仪器必须有良好的稳定性 单点校正法 当被测试样中各组分浓度变化范围不大时,可不必绘制多点的标准 曲线,而用单点校正法(比较法)。配制一个和被测组分含量接近的标 准溶液,定量进样,根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被 测组分的含量。 wi A i = ws A s 当方法存在较大的系统误差, 单点校正法的误差较大。 内标法 浓度 目标 内标 面积 面积比: 目标/ 内标 标准曲线 CIS A3 /AIS A2 /AIS A1/AIS A3 AIS C3 CIS A4 AIS C4 CIS C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS 浓度比: 目标 / 内标 内标法 试样配制:准确称取一定量的试样Wi,加入一定量内标物WS 计算公式: wi = f i Ai ws = f s As f i AiAi wi =ws = f i ws f s AsAs fi′为待测组分 (i) 对内标物 (s) 的质量相对校正因 子 内标法特点 多用在国际标准和规定比较严格的方法中 特点: 1、进样量不严格要求 2、只对所测组分作校正 3、必须在样品中加一内标组分 4、操作较为繁琐 5、选择内标物比较困难 选择内标物应注意 1、理化性质与待测物相近 2、在样品中不存在且不与样品中组分发生化学反应 3、内标物与待测物响应相近 4、与待测物有良好的分离,但又不能相距太远 5、与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好,因此要根据待测物 的 浓度确定内标物的添加量 标准加入法 当难以选择合适的内标物或无空白样品时,以欲测组分的纯物 质为内标物加入到待测样品中,然后在相同的色谱条件下,测定加 入欲测组分前后的峰面积,从而计算待测组分的含量。 wi = f i Ai wi + Δwi = f i Ai wi + Δwi Ai = wiAi fi = fi Δwi wi = Ai ?1 Ai 标准加入法特点 1、不需另外选择内标物 2、进样量不必十分准确,操作简单 3、两次色谱条件完全相同以保证校正因 子完全相等 定量计算常用术语 Integration parameters :积分参数,规定计算出峰面积的方法 Identification : 定性参数,保留时间及允许误差 Quantification method: 定量方法,选择定量方法(外标法,内标法等) Curve fit Type: Compound table: 曲线拟合类型,包括线性、二次方程等 化合物表,定义要进行定量计算的组分,其中 包括定性和定量参数 1) Type: 组分类型,指组分的分析类别 Target:要计算的目标组分 ISTD:指该组分为添加的内标组分 Reference: 指该组分为参比组分,用来对目标组分进行确认 ISTD&Ref.: 指该组分既是内标组分,又是参比组分 2) Conc: 浓度,指目标组分的计算结果 定量计算常用术语 Sample Type :样品类型,规定该数据的计算类别 Standard :标样, 浓度已知的标准品,用来制作标准曲线 Unknown :未知样,浓度待测的目标组分 Sample Amt.:样品量, 待测样品的原始称样量, 在计算结果中会除以该数值 Dil. Factor :稀释因子,待测样品的稀释倍数,在计算结果中会乘以该数值 ISTD Amt. :内标量,内标组分的添加量 Level :样品浓度水平,规定数据的浓度级别, Unknown为0, Standard为整数,浓度由低到高依次为1、2、3、4、5… … Peak Table : 峰表,所有积分结果的列表 数据处理参数 积分参数:(Width, Slope, Drift, T.DBL等) 定性参数:保留时间及允许误差(时间窗,时间带) 定量参数: 1) 定量方法:外标法、内标法、面积归一法等 2) 曲线) 曲线拟合:线性、折线、曲线 积分参数 积分参数 基本积分参数 Channel:通道,指定检测器检测信号的通道 Width :半峰宽,峰的半高宽,排除峰宽小于最小峰宽的峰 Slope :斜率,用来判断出峰起点、终点以及滤除低平噪声 Drift :漂移,判断相邻峰的积分方式 设定值为0时,积分仪将自动判断 如Drift与基线至峰谷连线较接近时,积分面积值可能变化较 大 T.DBL :时间变参,根据时间自动改变峰宽和斜率 Minimum area:最小峰面积,排除面积小于该值的峰 Slope的设定 Slope Slope Slope峰斜率,作为峰计 算 Slope Slope峰斜率,作为噪声滤除 Slope Slope≈峰斜率,积分不稳定,须手动设 定 Drift值的设定(手动校正) Drift Drift Drift Drift Drift Drift 注:1) 设定值为0时,积分仪将自动判断 2) 如Drift与基线至峰谷连线较接近时,积分面积值可能变化较大 Drift值的设定(自动校正) 谷宽半峰高宽度 T2T1 谷宽半峰高宽度 T2T1 T.DBL的设定 T.DBL:时间变参,根据时间自动改变峰宽和斜率 等度洗脱时,出峰时间越长,峰越宽 设定值为0时,根据宽度自动判断 默认值为1000,此时该参数不起作用 在实际使用中,一般使用默认设定 积分锁定 Integration Off to On:锁定某一时间范围的峰,使之不计算积分 mAU (x10) 2.5 202nm4nm (1.00) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min Integration Off to On 定性参数 定性参数 绝对保留时间 相对保留时间 保留时间允许误差 时间窗:相对允差, 一般设为5% 时间带:绝对允差, 一般设为0.05~0.25 min 定量参数 定量参数 定量方法: 面积归一法、外标法、内标法等 工作曲线的制作: 曲线点数:一点、两点及多点 曲线计算:线性、折线、二次曲线、三次曲线 影响定量结果的因素 保留时间的重现性(对GPC影响很大) 样品问题(杂质、溶剂、稳定性、配制) 进样问题(准确度和精密度) 检测器的性能(影响线性、检出限、灵敏度) 方法的可靠性 积分参数的设定 第四部分 维护基础知识 日常维护 目的:维持仪器处于正常运作状态,有效的降低仪器发生故障的 频率,延长仪器的使用寿命。 准备工作: 使用&维护日志 设备的耗材和备件 维护工具盒 试剂(甲醇、异丙醇、稀硝酸等) 超声波清洗机 液相系统维护流程图 线路过滤器 单向阀 色谱柱 柱塞密封圈 进样器 检测器 吸滤头 输液系统日常维护部件 排液阀 清洗流路密封圈 柱塞 保险丝 柱塞密封圈 吸滤头 主进口单向阀 线路过滤器 辅助进口单向阀 管线选择 材料 不锈钢 特氟隆 (Teflon) 聚醚醚酮 (PEEK) 尺寸 不锈钢材质管路 0.1 mm I.D. x 1.6 mm O.D. 0.3 mm I.D. x 1.6 mm O.D. 0.5 mm I.D. x 1.6 mm O.D. 0.8 mm I.D. x 1.6 mm O.D. 0.13 mm I.D. x 1.6 mm O.D. 0.25 mm I.D. x 1.6 mm O.D. PEEK材质管路 管线材料 不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几百MPa 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 25 MPa压力 可在整个pH范围(pH 1-14)内使用 不适用高溶解性溶剂如三氯甲烷、四氢呋喃等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 仅能承受 0.5 MPa压力 管线材料 使用高溶解性溶剂如氯仿、THF等 当ID.0.25 mm或0.13 mm、氯仿、THF 25 %以下,10 MPa以下的使用 条件时,在实际应用中一般没有问题。 特氟隆材质管路 作为废液管的时候,请勿随意增长或缩短其长度。增长管路,会提高 背压,有损坏检测器的危险;缩短管路,容易使得检测器内产生气泡 。 接头 不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的管路连接 能承受 40 MPa以上的压力 一旦固定,垫圈不可再动 不锈钢接头 垫圈 PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的管路连接 易于安装 能承受 25 MPa的压力 容易产生死体积 PEEK接头 死体积 产生原因:由于管路连接不好产生的额外体积 死体积可能会引起分离度下降和重现性变差等问题 色谱柱 公螺母 死体积 管线 好的连接 差的连接 吸滤头 材料:不锈钢烧结(或陶瓷),孔径 10 μm 功能:防止较大固体不溶物进入液相色谱 系统 日常维护:定期使用异丙醇(或5%稀硝酸) 清洗 故障:吸滤头堵塞 现象:管路中不断有气泡生成 措施:用异丙醇(或5%稀硝酸)浸泡并进行超声波浴清洗,再用蒸 馏水清洗至中性 LC-20AT 选配件支 架 压力传感器 泵头固定座 泵头 辅助进口单向阀 主进口单向阀 LC-20AT LC-20AD 选配件支架 出口单向阀 压力传感器 泵头 泵头固定座 进口单向阀 进液口 LC-20AD 单向阀结构 注意: 请不要分解阀心A和阀心B 重新组装后性能不被保证,输液可能不稳定 单向阀故障处理 故障:宝石球或球座受污导致密封不好 表现:系统压力波动大 措施: 1)打开排液阀,用泵输送或用注射针打入异丙醇进行清洗 2)拆下单向阀,放入异丙醇中,超声波浴清洗 注意:超声波清洗时开口端向上放置。 单向阀故障处理 故障:宝石球粘附于垫片 表现:泵无法吸液或排液,流路不通 措施:1)用针筒抽出口单向阀,利用产生的负压使宝石球 与垫片分开。 2)拆下单向阀,放入异丙醇或水中,用超声波浴清洗。 柱塞密封圈 柱塞密封圈 LC-20AD LC-20AB LC-10ADvp 部件号228-35146 取下和安装 柱塞密封圈工具 柱塞密封圈 LC-20AT LC-10ATvp 部件号:228-35145 柱塞密封圈故障处理 密封圈 故障:密封圈磨损导致密封不良 现象:系统压力波动大或漏液 措施:更换密封圈 柱塞杆 注意: 拆卸泵头前,必须将柱塞杆复位 (仪器面板上的P-SET界面) 流动相 泵头清洗管路 线路过滤器 排液阀 压力传感器 故障:堵塞 现象:系统压力偏高 判断依据:关闭排液阀,断开出口管路, 设定流速1mL/min,如压力0.3 MPa, 可以判定为线路过滤器堵塞。 措施:以异丙醇(或5%稀硝酸)为清洗剂,超声波浴清洗。 再用水洗至中性。 线路过滤器 流动相 过滤器的更换 如果清洗无法解决故障,需要更换线路过滤器。 旧过滤器的取出 新过滤器的安装 新型号线 混合器 混合器不同体积的连接方法 混合器故障处理 常见故障:堵塞 混合器堵塞往往是由于混合 器过滤组件堵塞引起的。 处理方法: 按图中结构卸下过滤组件, 5%稀硝酸或其他溶剂超声波浴 清洗或更换新的组件。 标准或半微量混合器用 部件号:228-18872-93 LC-20AT 各部件定期检查和维护清单 检查/维护项目 更换柱塞密封圈 清洗并检查(更换) 柱塞 更换清洗流路密封 圈 检查(更换)辅助 进口单向阀并做超 声波浴清洗 检查(更换)主进 口单向阀并做超声 波浴清洗 检查(更换)并清 洗线年 备注 × 检查(更换)并清 洗吸滤头 更换排液阀 × × LC-20AD 各部件定期检查和维护清单 检查/维护项目 更换柱塞密封圈 清洗并检查(更换) 柱塞 检查(更换)膜片 检查(更换)出口 单向阀并做超声波 浴清洗 检查(更换)进口 单向阀并做超声波 浴清洗 检查(更换)并清 洗线路过滤器 检查(更换)并清 洗吸滤头 更换排液阀 泵组件润滑 × × × × 请咨询岛津各办事处维修部 × 6个月 1年 × × × 更换柱塞时同时更换 2年 3年 备注 × 手动进样器 手动进样器操作注意事项 针头密封垫 1. 进样请使用液相色谱专用平头进样针 2. 进样时,进样针应插入针导管到底 3. 清洗请使用专用进样口清洗器 不锈钢套 4. 样品溶液pH小于10, 常用密封垫的Vespel材质 弹簧 (适用pH10),否则换Tefzel或PEEK材质的 转子 5. 不使用手动进样器时将针头留在进样器内 密封垫(pH 0-14) 定子 手动进样器维护要点 1. 将附件进样口清洗器装在注射器上 2. 用注射器吸入清洗液 (试样溶液或者不含 盐的流动相等) 针导管 针管 3. 在进样(INJECT)状态下,将进样口清洗 器压接在针导管上,注入清洗液约1mL 4. 使用缓冲溶液后,用纯化水清洗流路和针 导管 进样口清洗器 手柄组件 5. 不能使用微型注射器清洗手动进样器 6. 请缓慢推压注射器,以免引起清洗液反喷 自动进样器 自动进样器各部件定期检查和维护清单 检查/维护项目 更换针管密封圈 更换柱塞密封圈 更换计量泵柱塞 更换低压阀转子 更换低压阀定子 × × 1年 2年 × × × 在大约60000次进样后更换 3年 6年 备注 在大约40000次进样后更换 更换高压阀转子 更换高压阀定子 更换定量环 清洗并检查(更换) × 溶剂过滤器 针管更换 保险丝更换 面板更换(仅适用 于SIL-20AC) 润滑油 × × × × 在大约100000次进样后更换 在大约40000次进样后更换 在大约40000次进样后更换 × 如果样品冷却器存在过的冷凝 则更换 请咨询岛津各办事处维修部 思考题 现象:在分析样品过程中,系统压力不断升高。 问题:如何确认压力升高的原因? 故障根源的确认:分段排除法 如果确认是由色谱柱引起的压力升高,应如何处理? 在实验过程中,如何避免这种情况出现? 色谱柱常见故障分类 柱压过高 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同色谱条件有差异 柱效低 重复性差 回收率低甚至不出峰 柱压过高 原因 微粒堵塞 解决方法 1. 正向冲洗色谱柱 2. 反向冲洗色谱柱 3. 超声清洗色谱柱筛板 不可逆吸附 日常使用注意点 细菌生长 1. 过滤流动相和样品 2. 恰当的样品前处理方法 3. 使用保护柱 4. 注意冲洗系统 柱效低 解决方法 1. 正向冲洗色谱柱 2. 反向冲洗色谱柱 3. 超声清洗色谱柱筛板 4. 柱内死体积增加,需更换新柱 原因 色谱柱被污染 筛板堵塞 日常使用注意点 柱内死体积增加 1. 定期冲洗色谱柱 2. 防止机械震动和柱压急剧变 化 3. 关注色谱柱柱效变化 例子:溶解样品的溶剂选择不当 假设:标准品溶剂为甲醇,样品溶剂为乙醇。 建议使用流动相溶解样品,不要选择高溶解性的试剂。 乙醇 作为溶剂甲醇 作为溶剂 20 uL Caffeine 20 uL Caffeine 乙醇 作为溶剂 10 uL Caffeine 注意:方法开发阶段,请选择 合适的进样量 色谱柱的使用注意点 购买新柱后请务必仔细阅读说明书,确认柱的使用条件以及清洗再生步骤。 按照说明书条件测试色谱柱柱效,保留所得色谱图,记录使用压力 定期检测柱压和柱效 不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性 确认样品在流动相中有好的溶解度;进样前请使用0.45 μm或0.2 μm的一 次性滤膜过滤样品,或者进行其他前处理 为了延长色谱柱使用寿命,请使用保护柱。 定期用合适的溶剂(说明书推荐的溶剂)清洗或再生色谱柱 长期不用色谱柱时,应在彻底清洗后使用说明书中指明的溶剂保存柱子。 然后从仪器上卸下色谱柱,用堵头密封保存 定期用合适的流动相清洗保存的柱子,避免干涸 紫外检测器 紫外检测器 样品池 硅光电池板 光线 参比池 检测器基线异常 基线噪音异常大 输液泵或检测器内存在气泡 检测器污染 灯老化 出现漂移或波动 系统污染,如色谱柱、管路、检测器和流动相等等 室温变化(如空调出风口直吹检测器) 紫外检测器故障判断 性能判断 SMPL EN REF EN 新的时候 800 900 A 100 800 B 100 150 A:池子、透镜污染 B:灯老化 检测池清洗 故障:样品池污染 表现:样品池和参比池能量相差较大 检查方法:设定250 nm波长,通甲醇或水,查看SMPL EN 和REF EN, 如两者相差较大,则样品池污染。 措施:用针筒注入异 丙醇,清洗样品池; 如污染严重,拆开样 品池,将透镜等放入 异丙醇中清洗。 紫外灯的保养 氘灯保证寿命为2000小时 保证仪器的使用环境 在分析前、柱平衡得差不多时,再打开检测器紫外灯 不要频繁的开关紫外灯,同样会损害紫外灯的寿命 一般间隔时间在三小时以上。 更换氘灯 判断氘灯能量: 设定220 nm波长,检查参比池能量, 如能量低于800mV, 需考虑更换氘灯。 部件号:228-34016-02 SPD-10A/SPD-10Avp SPD-20A/AV用 部件号:228-34016 SPD-M10Avp/SPD-M20A用 更换氘灯 二极管阵列检测器维护 光源使用时间检查 D2 灯建议使用时间: 2,000小时 W灯最长使用时间: 2,000小时 D2达到额定寿命后, 如果满足使用灵敏度 要求,可继续使用 W灯达到额定寿命后 , 必须进行更换。 灯强度检查 建议评判标准: D2:200-260 nm或附近,最大强度 ≥3.5 V W :400-800 nm或附近,最大强度 ≥2.5 V 灯强度检查注意事项 排除流通池中的气泡 用水、甲醇或乙腈替换流通池中的溶剂,使用230 nm 以 上无紫外吸收的溶剂 流通池窗无污染 灯使用寿命检查 灯强度检查操作步骤 1. 将水、甲醇或乙腈注入流通池。 2. 3. 4. 流通池清洗 氘灯的更换 取下灯罩后灯会自动熄灭,无法打开,务必在打开灯前安装灯罩。 思考题 1.如何简单判断脱气机脱气是否正常? 打开Purge阀,设定泵的流速 2 mL/min,提起当前所使用溶剂瓶内的溶剂 过滤头,使之脱离液面一小段时间,此时溶剂传送管内会产生一小段气泡,放 下过滤头,让此段气泡通过脱气机,如果脱气机正常,气泡应消失或缩小。 2.泵压力不正常可能由那些原因引起? 气泡,入口/出口单向阀故障,密封垫或柱塞杆磨损,渗漏或堵塞,传感器 故障,比例阀故障,使用比例阀混合时盐浓度太高。 3.基线噪音大可能由那些原因引起 ? 泵压不稳,气泡,色谱柱污染,系统管路污染,流通池污染,灯强度不足 ,光学系统老化或污染,参数设置不合理。 日常维护小结 保持仪器的工作环境良好(温度,湿度,洁净度等) 填写使用&维护日志,关注耗材寿命 做好泵的保养(使用缓冲盐时要清洗柱塞;水和盐不长期保 存在泵里) 经常清洗进样器,防止污染物吸附或管路堵塞 定期清洗色谱柱,保证色谱柱性能,延长使用寿命 定期清洗检测器流路,防止污染物吸附 长时间不使用液相色谱仪,须将所有部分全部更换为70%以 上的甲醇水溶液,防止管路污染或堵塞 小结:遇到故障如何处理? 故障的确定 至少要重复出现两次以上 初步判断故障引起的原因 方法或硬件 由经验或平时的积累确定故障原因 平时做好观察和记录 当不能确认故障原因时 采用排除法逐一考察可能引起故障的因素 确定故障能否自行处理 不要贸然拆卸不熟悉的部件 开关机前想一想,看一看 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. HPLC系统中各部分是否开机正常 溶剂瓶内溶剂是否新鲜且脱气 泵是否已初始化且工作正常 系统管路及电路是否连接正常 检测器是否通过自检且工作正常 溶剂的pH值是否合适 对温度敏感的检测器是否被阳光直射或被空调直吹 溶剂瓶是否被阳光直射 停机前是否将系统及柱子中的缓冲液置换干净 较长时间停机之前是否将柱子取下, 且系统最后用甲醇冲洗过(系统不能 长时间保存有缓冲液或THF) 样品在流动相中是否具有良好的溶解度 所选用的过滤膜是否正确 若用手动进样器,所用的进样针是否正确 11. 12. 13. 切忌下列操作 1. 示差折光检测器/荧光检测器的出口管路堵塞 2. 直接用甲醇置换缓冲液 3. 样品会在流动相中产生沉淀 4. 用水溶性滤膜过滤有机溶剂 5. 溶剂,特别是缓冲液泄漏在仪器内部 6. 高温使用下的柱子尚未降温就停泵 7. 阳光直射溶剂瓶或检测器 8. 空调直吹检测器 9. THF在不密封情况下长期存放 故障(压力升高)确认流程图 确认流速、溶剂比例设置正确 设置正确的流速、溶剂比例 确认环境温度 使用柱温箱,设置合适的柱温 旋松检测器废液出口接头 出口连接管堵塞,更换/清洗 旋松检测器入口接头 流路(检测池)堵塞,清洗 旋松色谱柱出口接头 出口连接管堵塞,更换/清洗 旋松色谱柱入口接头 色谱柱堵塞,清洗/更换新柱 压力下降 故障依旧 故障(压力升高)确认流程图 旋松保护柱/线路过滤器出口接头 出口连接管堵塞,更换/清洗 旋松保护柱/线路过滤器入口接头 保护柱/过滤器堵塞,清洗/更换 旋松进样器出口接头 出口连接管堵塞,更换/清洗 旋松进样器入口接头 进样器/连接管路堵塞,清洗 旋松混合室入口接头 连接管路/混合室堵塞,清洗 旋松泵出口接头 连接管路堵塞,清洗/更换 请联系工程师 压力下降 故障依旧 故障(保留时间重复性差)流程图 确认流速、溶剂比例设置正确 设置正确的流速、溶剂比例 确认流动相配制过程是否正确 按照正确方式重新配制(pH 值等) 确认流动相是否脱气 排除气泡,流动相脱气 确认是否使用柱温箱 保持环境温度恒定/使用柱温箱 确认泵流速是否稳定 联系工程师检修设备 确认管路接头是否密封良好 拧紧接头 否 是 故障(保留时间重复性差)流程图 确认色谱柱是否正确 更换正确的色谱柱 确定是否有足够的时间平衡柱 子 确定色谱柱柱效是否良好 重新充分平衡色谱柱 清洗/更换色谱柱 充分混合流动相/充分平衡柱子 设置正确的梯度延时时间 是否使用梯度洗脱 梯度延迟时间是否正确设置 请联系工程师 否 是

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